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开放存取专题论文文章
在保留耳聋豚鼠的听觉神经方面，BDNF优于TrkB激动剂7,8,3-THF
通过亨克·温克1,2，威廉·范·多普1，汉斯GXM泰默尔1,2，惠布Versnel1,2，*和DyanRamekers1,2
抽象在使用人工耳蜗（CI）进行听力恢复的失聪受试者中，听神经会退化，这可能会对CI的有效性产生负面影响。这种神经变性可以通过神经营养治疗来减少。在这里，我们比较了天然酪氨酸受体激酶B（TrkB）激动剂脑源性神经营养因子（BDNF）和小分子TrkB激动剂7,8,3-三羟基黄酮（THF）对听神经的防腐作用聋的豚鼠。在整个耳蜗中，THF可能比BDNF更有效，因为它具有更好的药代动力学特性。通过将明胶海绵放置在穿孔的圆窗膜上来递送神经营养化合物。为了补充螺旋神经节细胞（SGC）的组织学，治疗开始后四周进行电诱发的复合动作电位（eCAP）记录。我们分析了eCAP相间间隙（IPG）的影响和源自脉冲序列诱发eCAP的措施，均表明SGC健康。与未处理的对照组相比，BDNF而非THF产生的SGC存活率显着高于基底耳蜗。关于IPG效应和脉冲序列反应，BDNF处理的动物比未处理的动物和THF处理的动物表现出更多的正常反应。因此，我们已经证实了BDNF的保护作用，但是我们尚未证实先前报道的THF具有我们临床适用的递送方法的保护作用。均表明SGC健康。与未处理的对照组相比，BDNF而非THF产生的SGC存活率显着高于基底耳蜗。关于IPG效应和脉冲序列反应，BDNF处理的动物比未处理的动物和THF处理的动物表现出更多的正常反应。因此，我们已经证实了BDNF的保护作用，但是我们尚未证实先前报道的THF具有我们临床适用的递送方法的保护作用。均表明SGC健康。与未处理的对照组相比，BDNF而非THF产生的SGC存活率显着高于基底耳蜗。关于IPG效应和脉冲序列反应，BDNF处理的动物比未处理的动物和THF处理的动物表现出更多的正常反应。因此，我们已经证实了BDNF的保护作用，但是我们尚未证实先前报道的THF具有我们临床适用的递送方法的保护作用。
关键词：耳蜗;听力损失;神经变性;螺旋神经节细胞;eCAP;IPG效应;神经保护;神经营养因子;神经刺激;小分子
1.简介Corti器官中的耳蜗毛细胞受损或丢失会导致感觉神经性听力损失（SNHL）。如果发生严重至严重的SNHL，可以通过人工耳蜗（CI）来部分恢复听力，该人工耳蜗可以直接电刺激构成听神经的螺旋神经节细胞（SGC），从而绕过受损和/或丢失的毛细胞。作为柯蒂氏器还通过神经营养支持[装置保持的SGC1，2，3]，该结构的损伤，包括毛细胞的损失，导致的SGC[变性4，5，6，7，8，9]。有证据表明，在CI用户，听觉神经的健康受到损害，这可能CI有效性[负面影响10，11]。因此，为了改善CI使用者的听力，已经在动物研究中做出了巨大努力以防止神经变性。
为了防止SGC退化，许多研究已经调查了神经营养因子的外源性给药，特别是天然存在的神经营养因子的脑衍生神经营养因子（BDNF）的效果，这显著增强SGC存活聋豚鼠（例如，[1，12，13，14，15，16，17，18，19，20]），猫[21，22]和大鼠[23]。这些动物研究铺平道路，可能的人类应用的好处CI用户[24，25]，或作为潜在的治疗，以抵消synaptopathy[26，27]。重要的是，外源性BDNF的治疗不仅对听神经的结构存活有积极作用；其回应电流脉冲，通过一个CI的规定外，还提高了显著[14，19，21，28]。尤其是，改变这些双相电流脉冲的受试者内部相间间隙（IPG）会导致电诱发的复合动作电位（eCAP）发生变化，这在聋的动物和听力正常的动物之间明显不同，这表明采取了一种措施耳蜗健康[19]。IPG对BDNF治疗的聋哑豚鼠eCAP的作用已证明听神经的反应接近正常[19]。最近在一些人体研究中表明了这种IPG措施的相关性，表明与绝对eCAP措施不同，IPG效应与电极位置无关[29]，因此该受试者内效应可能是一种有效的诊断工具（例如，[30，31]）。这表明IPG效果可以像豚鼠一样对人类CI使用者的耳蜗健康提供有益的信息，进一步强调了本研究的临床意义。
通过微型渗透泵将药物输送到内耳的侵入性（通常在上述动物研究中使用）由于需要最终手术切除以及感染或丢失的风险而在临床上受到限制。残余听力。作为临床上更可行的替代方法，已将BDNF在可吸收的明胶海绵或水凝胶中局部应用到圆窗膜（RWM）上也能促进SGC的存活，尽管效果不如直接注入耳蜗[32，32]。33，34，35]。据认为，这种次最佳效果仅限于RWM附近的基底性耳蜗转向，部分原因是BDNF的药代动力学特性相对较差[36，37]，在整个运动耳蜗主要取决于被动扩散和大分子扩散缓慢[38，39]。
在基于细胞的和虚拟筛选，小分子模拟在其靶受体酪氨酸受体BDNF的效应激酶B（TrkB的）-具备被发现[40，41，42，43，44]，着眼于药代动力学和药效学特征与BDNF相比。Yu等。[45，46]报道与小分子的TrkB激动剂7,8-二羟基黄酮（DHF）和7,8,3-三羟基黄酮（THF），对那些与BDNF在耳蜗器官型培养物处理过的处理后类似SGC存活。同一组小鼠进行的体内实验甚至显示SGC的存活率与正常听力对照组相似[46]，进一步强调了这种小分子TrkB激动剂的潜在潜力。另外，在一项体外研究中，THF被证明可诱导神经突生长[47]，尽管其作用要比BDNF小。
由于Yu等人的体内结果。[46]在小鼠中非常有前途，本研究检查了THF对SGC的防腐作用，与BDNF相比。这些可营养的化合物是通过可吸收的明胶海绵涂在RWM上的，其递送方法与Yu等（）中的相同。[46]，在耳毒性耳聋的豚鼠模型中。通过（1）SGC生存数字和（2）通过eCAP记录对SGC进行功能评估来确定SGC的保存。我们假设，与BDNF相比，THF具有更好的药代动力学和药效学性质，因此，与BDNF相比，THF在整个耳蜗中具有更好的保存和功能。但是，相反，我们的结果表明，BDNF在听神经的结构和功能保存方面均优于THF。
2。材料和方法2.1。动物与实验设计从Envigo（荷兰赫斯特）获得四十五只雌性豚鼠（DunkinHartley；HsdPoc：DH；-g），并保持在标准实验室条件下（随意进食和饮水；上午7:00之间点灯）和7:00pm；温度21°C；湿度60％）。所有动物在进行任何实验程序之前都具有正常的听力，这是通过点击诱发听觉脑干反应（ABR）进行评估的。实验过程的示意图概述如图1所示。将动物分为正常听觉对照组（NH；n=9），以及三个实验组，它们通过卡那霉素和速尿的全身联合给药而耳毒性耳聋。耳聋两周后，对动物进行手术，以使其明胶海绵浸泡在右耳穿孔的圆窗膜上的磷酸盐缓冲液（PBS）中，该盐缓冲液中含有BDNF（n=12）或THF（n=11）；阴性对照组仅接受PBS（6WD;n=13）。耳聋后四周，动物在其处理过的耳朵中接受耳蜗内电极阵列，在处死动物之前用它们进行eCAP记录。终止后立即对处理过的和对侧未处理的耳蜗进行组织学处理。所有外科手术和实验程序均已获得荷兰中央动物科学程序管理局（CCD：和5）的批准。
图1.实验过程的示意图。ABR：听觉诱发听觉脑干反应；CI：人工耳蜗；eCAP：电诱发的复合动作电位。
2.2。外科手术2.2.1。震耳欲聋的程序在震耳欲聋之前，先肌肉注射右美托咪定（Dexdomitor；Vetoquinol，Breda，荷兰；0.25mg/kg）和氯胺酮（Narketan；Vetoquinol；40mg/kg）麻醉，然后术前通过皮下镇痛记录卡洛芬注射液（Carporal；荷兰Oudewater的Dechra/ASTFarma；4mg/kg），并记录单击诱发的ABR以验证听力正常（参见[48详情）。阈值40dB峰值等效声压级被认为表明听力正常。通过皮下注射卡那霉素（美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich；mg/kg），然后将速尿（Centrafarm，Etten-Leur，荷兰；mg/kg）输注到颈外，来进行耳聋静脉，这已被证明是可靠地消除大部分内和外毛细胞[的9，49]。
2.2.2。明胶海绵介导的治疗耳聋手术后两周，再次用氯胺酮和右美托咪定麻醉动物，并给予卡洛芬作为术前镇痛药，然后记录单击诱发的ABR，以确认动物已充分耳聋。阈值偏移50dB的动物被认为成功失聪，并被纳入研究。随后，通过耳后入路暴露右耳蜗大疱。在大疱中开一个小孔，露出耳蜗的圆窗膜（RWM）。甲micropick使用了小吸收止血明胶海绵（Spongostan?牙科;爱惜康，萨默维尔，NJ，USA）之前刺穿RWM气缸（?1毫米3），在处理溶液中的3μL浸泡，放入圆窗口利基（请参阅[35]，其图1）。处理溶液由含有BDNF（PeproTech，伦敦，英国；溶于PBS中的6.67μg/μL（μM））或7,8,3-三羟基黄酮（SantaCruzBiotechnology，Inc.）的PBS和15％二甲基亚砜（DMSO）组成。，德国海德堡；0.μg/μL（μM））。为了使THF溶解，需要添加15％的DMSO，并且出于可比较的目的，对于所有失聪的基团维持该添加。放置明胶海绵后，用牙科用水泥（GCFujiPLUS；GCCorporation，日本东京）将大疱密封。
2.2.3。急性植入明胶海绵放置4周后，麻醉诱导Hypnorm的注射?（Vetapharma;0.5毫升/千克IM）和2％异氟烷蒸发为O的气体混合物的后续施用2和N2O（1：2）通过口罩暴露颅骨，将两个经颅螺钉置于前reg两侧1cm处，以用作eCAP记录的参考电极。随后对动物进行气管切开术，并用O2和N2的混合气体进行人工通气（阿姆斯特丹婴儿呼吸机mk3，Hoekloos，斯希丹，荷兰）。在整个实验剩余时间内，O（1：2）和1-1.5％的异氟烷（45-50个循环/分钟呼吸速率，1.8-2.3kPa）。重新打开大疱以暴露耳蜗。然后在距圆形窗口1mm以内的基底转弯处钻一个0.5mm的耳蜗切开术，通过该操作将定制的四触点电极阵列插入到鼓膜的鼓膜中。将该阵列连接至MED-ELPULSAR人工耳蜗（MED-ELGmbH，奥地利因斯布鲁克）。
2.3。电生理学2.3.1。ABR录音在耳毒性耳聋之前和开始治疗之前，使用三个皮下针状电极记录单击诱发的ABR：（1）将接地电极放在后肢中；（2）右耳后方的有源电极；（3）参比电极放置在颅骨上，位于大脑的头部。使用TDT3系统（Multi-I/O处理器RZ6；Tucker-DavisTechnologies，Alachua，FL，美国）合成并衰减了宽带声点击（20μs单相矩形脉冲；激励间隔99ms）并进行了衰减，并免费提供使用Blaupunkt扬声器（PCxb;4Ω;30W，Blaupunkt（International）GmbH＆Co.KG，希尔德斯海姆，德国）在距右耳10cm处的磁场中。为了扩增ABR，使用了普林斯顿应用研究公司（美国田纳西州橡树岭）前置放大器（放大倍数为；带通滤波器0.1–10kHz）。随后，响应由TDT3系统数字化（kHz采样率，24位sigma-delta转换器），并存储在PC上以进行离线分析。通过从dB峰值等效声压级开始，然后将声级降低10dB，直到未观察到进一步的响应，来确定听力阈值。然后将阈值定义为ABRN的内插声级1-P2峰为0.3μV。
2.3.2。eCAP记录如Ramekers等人所述，执行了两种eCAP记录协议。（[48]，单脉冲协议；[19]，脉冲序列协议）。植入物由PC通过研究接口盒2（奥地利因斯布鲁克的因斯布鲁克大学离子物理和应用物理系）和NationalInstruments数据采集卡（PCI-，NationalInstruments）控制。使用MATLAB（7.11.0版；美国马萨诸塞州内蒂克市Mathworks公司）执行刺激/记录范例。通常，将耳蜗内阵列上的四个电极中最顶端的一个用于刺激（耳蜗切开术内部约4mm），而最基础的一个则用于记录。对于这两种方案，都以交替的极性呈现了30μs/相的双相电流脉冲，以减少刺激伪像，并平均了对50对刺激的响应。
对于单脉冲记录，刺激的相间间隙（IPG）为2.1或30μs。如图2A所示，改变此IPG会导致eCAP的差异，这表明神经健康[48]。对于两个IPG，脉冲均以20个电流水平提供，通常为40μA至μA。，最大电流范围为μA至1μA（：n=24；：n=8；：n=4；：n=2；1：n=1）。
图2.单脉冲eCAP记录示例。（A）来自未经治疗的6周耳聋（6WD）和正常听觉（NH）动物的eCAP，其IPG为2.1或30μs。N1代表波形的第一个负峰值，P2代表波形的第二个正峰值。红色垂直线表示eCAP的N1等待时间。（B）在A的同一只NH动物中，IPG为2.1μm（灰色）和30μs（黑色）的N1-P2振幅的输入-输出函数。该线表示玻耳兹曼曲线拟合（公式（1））。彩色虚线表示从上述Boltzmann方程得出的各种eCAP特性。IPG：相间间隙。
脉冲序列由一系列十个相同的双相电流脉冲组成，在单脉冲记录中使用的最大电流电平为30μsIPG。为了能够记录对10个脉冲的脉冲序列中每个脉冲的响应，以十个步骤记录了eCAP，其中刺激脉冲的数量从1增加到10（请参见图3A）。因此，选择脉冲间间隔（IPI），以使最长的（16ms）不会引起任何折射或适应性（即，每个连续脉冲均会引起类似的大响应），而最短的（0.4ms）会导致瞬态eCAP的消失是由诸如耐火性，神经疲劳或适应性机制引起的（图3B）。
图3.从单个脑源性神经营养因子（BDNF）治疗的动物到脉冲序列的eCAP记录示例。（A）eCAP响应1个（最低迹线）到10个（上部迹线）脉冲的脉冲序列，脉冲间间隔（IPI）为0.6毫秒。可以观察到奇数和偶数脉冲的交替模式。这些eCAP的N1-P2峰值幅度在（C）中显示（0.6ms迹线）。（B）响应具有各种IPI的脉冲序列的最后（第十个）脉冲的eCAP。这些eCAP的N1-P2峰值幅度在（C）中显示（所有迹线的最后一个数据点）。（C）eCAPN响应具有10个不同IPI的脉冲序列中的所有10个脉冲，P1-P2峰值幅度。
2.4。组织学处理终止后提取经处理和未经处理的对侧耳蜗。如DeGroot等人所述，通过在0.08M的椰油酸钠缓冲液中加入3％戊二醛，2％甲醛，1％丙烯醛和2.5％二甲亚砜（DMSO）的固定液，通过迷宫内输注固定耳蜗。[50]。耳蜗被脱钙，后固定并包埋在Spurr的低粘度树脂中。使用在蒸馏水中的1％亚甲蓝，1％AzurB和1％硼砂进行染色。随后，将耳蜗沿着标准化的中颌平面分成两半，然后重新嵌入新鲜的树脂中。从这些一半中的至少一半以至少60μm的间隔切下两个半薄（1μm）的切片，将其用于SGC的定量。
2.5。数据分析2.5.1。电生理分析对于单脉冲分析，将eCAP幅度（定义为N1和P2峰值之间的电压差（图2A））相对于电流水平作图，得到输入输出功能，如图2B所示。随后，如Ramekers等人所述，将它们装上Boltzmann乙状结肠。[48]
Vè?一个P=A+乙1+?-一世?Cd，
（1）
其中VeCAP是幅度，单位为μV，I是激励电流，单位为μA，AD是拟合参数。从拟合参数中，可以得出以下几种量度（见图2B）：最大N1-P2幅度（B），达到最大幅度一半的电流（C），在C处的斜率（B/4D），阈值（C-2D）和动态范围（4D）。除了这些输入输出特性外，还分析了在三个最高电流水平上平均的N1峰值延迟。
如Ramekers等人所述，对eCAPs响应脉冲序列的分析在很大程度上完成了。[51]。由于ECAP?1-P2振幅随IPI（减小图3B），交替的模式出现（图3A，C），其幅度的先前已显示对SGC存活[被负相关19，51]。为了仅在脉冲序列的末尾包含稳定的交替模式，排除了对前四个脉冲的响应（图3）。C）。通过将奇数脉冲和偶数脉冲之间的这种调制幅度除以每只动物的最大eCAP幅度（由十个脉冲中的第一个引起），可以将其表示为相对度量。所有分析均使用MATLAB中的定制软件进行。
2.5.2。组织学分析将安装在LeicaDMRA光学显微镜上的LeicaDCF数码相机与40倍油浸物镜一起使用（LeicaMicrosystemsGmbH，德国韦茨拉尔），以获取耳蜗区域B1，B2，M1，M2，A1，A2的罗森塔尔运河的显微照片和每个耳蜗的两个部分的A3（图4A）。左右耳蜗的A3区域只能在36只动物中的17只获得；对于其他所有区域，这至少是36个中的33个。随后，使用ImageJ（1.52a版；美国国立卫生研究院，I版）确定了耳蜗区域B1t/mA2的I型和II型SGC的堆积密度和周缘面积通过概述罗森塔尔运河的骨边界并量化其中的SGC来确定贝塞斯达（美国MD）（图4公元前）。然后将两个部分的堆积密度取平均值。作为SGC大小可能影响检测它的可能性，如前所述[所得的填充密度为对于平均perikaryal区域校正，52，53]。对所有聋的动物和六只NH动物进行分析。
图4.（A）沿标准化的mo中平面的横截面。从这个横截面，定量分析了卢森塔尔管内的七个耳蜗区域B1-A3的螺旋神经节细胞（SGC）。（B）来自正常听力动物（NH）和（C）六周耳聋未治疗动物（6WD）的B1中罗森塔尔运河的例子。
2.5.3。统计线性混合模型（LMM）分析是在假设化合物对称性的情况下应用的，其中以耳蜗位置作为协变量并以治疗（BDNF对THF;BDNF对6WD或THF对6WD）作为因素。在此分析中，如VanLoon等人所述，位置以距位置B1的相对距离表示。（[53]，他们的图2）。通过对右（AD）/左（AS）比率执行log2转换并对每个耳蜗位置的每个组进行一次样本t检验，以0检验来评估治疗后的耳朵与对侧耳朵之间的差异。
使用独立样本t检验或单向ANOVA评估eCAP特征的组差异，然后采用事后Tukey的HSD进行评估。计算皮尔逊相关系数，以阐明单脉冲eCAP特征和脉冲序列响应参数与SGC存活率之间的关系。
在SPSSStatistics25.0.0.2中针对Windows（IBMCorp.Armonk，NY，美国）进行LMM分析，ANOVA和一样本t检验。使用MATLAB（版本9.1.0，Mathworks，Natick，MA，美国）计算Pearson的相关系数。
3.结果3.1。动物共融实验前确认所有动物听力正常。来自三个耳聋组（BDNF处理，THF处理和未处理的6WD）的动物成功聋了，平均ABR阈值偏移为76dB（范围从66到83dB）。一只用BDNF处理过的动物在准备急性eCAP记录时遭受了致命的呼吸道并发症。因此，对于这种动物，仅可获得组织学数据。对于所有其他动物，所有eCAP记录均已成功执行。但是，在一只6WD动物和一只THF处理的动物中，无法可靠地将Boltzmann曲线拟合到其幅度增长函数，因此，单脉冲分析中仅包括了它们的eCAP潜伏期。
3.2。螺旋神经节细胞存活图5显示了来自四个实验组的动物的耳蜗B1区域中SGC的典型显微照片示例。在正常听力的动物中（图5A），Rosenthal的根管密密麻麻地充满了SGC，而在耳聋六周后（图5B），可以观察到细胞大量减少，而其余细胞似乎比正常情况下要小。正常听力状态。在BDNF处理后（图5C），可以观察到SGC丢失，但是细胞看起来比未经处理的细胞更密集，并且SGC看起来更像健康细胞。THF处理后（图5D），变性是明显的，尽管似乎存在比未治疗更多的SGC，但是具有相似的形态。
图5.经治疗的右耳在耳蜗位置B1的罗森塔尔管中的SGC的代表性示例。（A）听力正常的动物；（B）未经治疗的6周聋（6WD）动物；（C）经BDNF治疗的动物；（D）7,8,3-三羟基黄酮（THF）处理的动物。
在图6A中，每组显示归一化的平均SGC堆积密度，其为距圆形窗口的相对距离中的耳蜗位置的函数（图6A中正常听力动物的绝对值；插图）。当比较实验组之间的右耳蜗时，BDNF治疗组的SGC堆积密度显示耳蜗位置B1和B2的SGC存活率高于未治疗的6WD组，但实际上与MWD位置的6WD组没有区别。从统计学上讲，BDNF处理的耳蜗的SGC堆积密度显着高于未处理的6WD耳蜗（线性混合模型；F（1,67.2）=6.3；p=0.），组与耳蜗位置之间具有显着的相互作用，证实了两者在耳蜗顶点之间的差异逐渐减小（线性混合模型；F（1,77.7）=13.8；p0.）。相反，尽管用thf处理的动物比未处理的6wd动物在b1区显示出更多的sgc残留，但是thf处理的效果在统计学上并不显着（线性混合模型；span=""F（1,41.9）=0.26；p=0.61），治疗和位置之间也没有交互作用。BDNF和THF处理组之间的差异无统计学意义（线性混合模型；F（1,41.3）=2.1，p=0.15）。令人惊讶的是，BDNF组的对侧耳朵显示出的SGC存活率明显低于THF组（线性混合模型;F（1,44.5）=4.2，p=0.），但不低于6WD对照组（线性;F（1,36.7）=1.7，p=0.20）。
图6.归一化的SGC堆积密度随距圆形窗口相对距离的耳蜗位置而变，其中圆形窗口为0％，螺旋体为％。（A）分别为右治疗的耳朵（AD，实线）和左未治疗的耳朵（AS，虚线）绘制的SGC堆积密度的组平均值。BDNFAD=指向下方的三角形；BDNFAS=向上三角形；THFAD=正方形；THFAS=金刚石。（B）对数变换的SGC填充密度比AD/AS。NH，n=6；6WD，n＝13，BDNF，n＝12；THF，?=11。B1到A2表示从基部到根尖的耳蜗位置。误差棒代表SEM。
由于BDNF处理比6WD对照动物导致更多的SGC生存，因此进一步研究了处理过的右耳和未处理左耳之间的差异（图6B中显示为log2转换的右/左SGC生存）。在耳蜗位置B1中，经BDNF动物右耳处理的SGC存活率是对侧耳朵中SGC的两倍以上（一次样本t检验；B1：t（11）=6.8；p0.）。耳蜗位置b2和m1的sgc存活率显着更高（单样本span=""t检验;B2：t（11）=2.5;p=0.;M1：t（11）=2.3;p=0.），并且在更顶端的耳蜗位置未观察到差异。
为了排除耳蜗操作（明胶海绵放置，RWM穿孔，CI插入）对SGC存活的影响，比较了未经治疗的6WD动物的右耳和左耳（图6B）。发生了严重的SGC丢失（约50％NH），在任何耳蜗位置，两只耳朵之间的统计学差异均无统计学意义（p0.3）。
3.3。螺旋神经节细胞对电刺激（eCAPs）的反应。用BDNF而不是THF处理可以提高SGC的存活率。为了检查BDNF治疗是否还导致了对电刺激的神经反应性的改善，并且尽管对SGC存活的影响有限，但为了检查THF处理是否会影响反应性，我们研究了实验组的几种eCAP措施。
3.3.1。绝对eCAP特性和IPG效果所示例的图2中，从2.1到30微秒的引线增加电流脉冲的IPG在ECAP特性的差异。在NH动物中，这会导致N1-P2峰幅度增加，斜率更陡，阈值降低，动态范围更宽，水平降低50％，而潜伏期不受IPG改变的影响。图7显示了eCAP输入输出特性的组平均值。请注意，在此图中，NH动物和两周聋的动物（2WD；先前由[48]）仅供参考。由于未治疗的6WD动物的eCAP测量值通常与NH和2WD动物的eCAP测量值显着不同，因此仅将6周耳聋的实验组用于随后的统计分析[48]。
图7.每个实验组的eCAP特征。双相电流脉冲的相间间隙（IPG）在左栏中为2.1μs，在中栏中为30μs。第三列显示了两者之间的差异（即IPG效果）。（A–C），最大振幅；（D–F），斜率；（G–I），阈值；（J–L），动态范围；（M–O），等级50％；（P–R），N1等待时间。2WD动物的数据来自Ramekers等人。[48]。NHn=9；6WD，n=12（对于延迟，n=13）；BDNF，n=11；THF，n=10（对于潜伏期，n=11）。*p0.05，**p0.01，***p0.。误差棒代表sem。span=""
当仅评估斜率（图7D，E）和动态范围（图7J，K）的绝对eCAP特性时，在组之间（表1）观察到统计学差异。IPG为30μs时，用BDNF处理的动物比未经处理的6WD动物具有更陡的斜率（TukeyHSD；p=0.）。此外，BDNF治疗组的IPG为30μs，具有正常的动态范围，该范围比未治疗的6WD和THF治疗组都窄（TukeysHSD；pBDNF-6WD=0.；pBDNF-四氢呋喃=0.01）。THF似乎没有影响SGC反应性，因为对于任何绝对eCAP特征，治疗组与未治疗的6WD组在统计学上均无差异（图7，前两列）。
表1.BDNF，THF和未处理的6WD组的单脉冲eCAP特征的单因素方差分析结果。
在检查IPG效果时，在实验组之间观察到Δ振幅（图7C），Δ阈值（图7I），Δ动态范围（图7L）和Δ水平50％（图7O）的差异（图7第三列；表1）。事后分析显示，BDNF治疗组的?振幅和?动态范围显着低于未治疗的6WD动物（图基HSD；振幅：p=0.；动态范围：p0.），并且更为正常。此外，尽管thf和bdnf处理均导致阈值阈值高于6wd，但这仅对bdnf有意义（tukey的hsd；span=""pBDNF-6WD=0.;对THF-6WD＝0.）。最后，尽管对于ΔNF水平为50％的动物，BDNF和THF处理的动物均与未治疗的动物没有显着差异，但用BDNF治疗后，ΔNF水平的50％小于THF（TukeysHSD；p=0.）。实验组之间的斜率（p=0.38;图7F）或潜伏期（p0.6;图7P–R）没有观察到差异。
3.3.2。单脉冲eCAP特性和SGC生存由于在耳蜗的B1和B2区域观察到了对SGC存活力最强的治疗作用，我们将B1和B2的SGC堆积密度平均为一个代表基础SGC堆积密度的值。随后，为了探索eCAP特征与其余SGC之间的关系，针对BDNF和THF治疗组的单个动物，将绝对eCAP特征和所有六个eCAP特征的IPG效应均作为基础SGC存活的函数（图8）。
图8.单个动物的eCAP特征与基础SGC堆积密度的关系。相间间隙（IPG）在左栏中为2.1μs，在中栏中为30μs。第三列显示了两者之间的差异（即IPG效果）。线代表仅在NH，2WD（来自Ramekers等人[48]）和未处理的6WD对照动物上的回归。实线表示R2，p值0.05，虚线span=""p值≥0.05。（A–C），最大振幅；（D–F），斜率；（G–I），阈值；（J–L），动态范围；（M–O），等级50％；（P–R），N1等待时间。2WD动物的数据来自Ramekers等人。[48]。BDNF，n=11；THF，n=10（对于潜伏期，n=11）。误差棒代表SEM。
黑色回归线代表NH和未经处理的6WD动物（来自本研究）和2WD动物（来自[48]）。在大多数绝对eCAP特征与IPG效应以及SGC细胞堆积密度之间观察到显着相关性，如图8中的实线所示。非显着相关性（图8G，H，J，K，M，O）以虚线显示。这些相关性的R2和p值列于表2。
表2.6WD动物在单脉冲eCAP特征与基础SGC生存之间的相关性得出的R2和p值。
对于两个IPG的绝对振幅（图8A，B），来自BDNF和THF处理组的动物似乎都没有遵循回归线，这表明这些动物的基础SGC存活率并未极大地影响最大eCAP振幅。同样，阈值（图8G，H），动态范围（图8J，K）和电平50％（IPG为2.1μs；图8M，N）似乎不受生存数量的影响所有治疗动物中的SGC。对于坡度（图8D，E），治疗的动物非常靠近回归线。BDNF和THF基团潜伏期的个体差异表明，通过治疗保留的SGC与该eCAP特征之间没有明确的关系。
对于Δ振幅，Δ斜率，Δ阈值和Δ动态范围（图8C，F，I，L），用BDNF和THF处理的动物接近回归线。对于?振幅（图8C），?动态范围（图8L）和?level50％（图8O），大多数BDNF处理的动物和一些THF处理的动物都位于该线下方，表明不管SGC的数量如何，都具有更正常的功能。
总而言之，用BDNF进行治疗不仅导致SGC的数量增加，而且导致功能保存。然而，未观察到通过六种eCAP特性评估的THF处理后SGC的功能保存。
3.3.3。脉冲列图9显示了源自脉冲序列刺激的两个eCAP特性。随着脉冲间隔（IPI；图9A）的减小，归一化的幅度调制（来自交替的N1-P2幅度，如图3A，C所示）变得更强。这在耳聋的动物中更为明显，在IPI处显示最高的调制时间为0.4和0.6ms。对于0.6ms的IPI，如Ramekers等人先前所示。[51]，未经处理的6WD动物的调制度显着高于NH动物（独立样本t检验；t（16）=5.0，p0.）。在该ipi下，bdnf和thf处理组的调节均低于未处理的6wd组，但并非如此（单向anova；span=""F（2,28）=3.2，p=0.）。对于所有组，随着IPI的减少，N1延迟（图9B中显示为由脉冲序列中最后六个脉冲引起的eCAP的平均延迟）会增加。未经治疗的6WD组的?N1潜伏期（IPI在0.6和16ms之间的N1潜伏期差异；见图9B中的虚线框）小于NH组（独立样本t检验；t（16）=4.1，p0.）。在三个耳聋的组中，观察到?N1潜伏期的差异（单向方差分析；F（2,28）=4.4，p=0.），而BDNF治疗组的?N1潜伏期显着高于未治疗组6WD组，与THF处理组无差异（TukeysHSD；pBDNF-6WD=0.，pBDNF-THF=0.95），且THF处理组的?N1潜伏期比未处理的6WD高，但无统计学差异组（TukeyHSD；p=0.）。
图9.脉冲序列响应参数。（A）为10脉冲序列的最后6个脉冲确定的归一化幅度调制的组均值，它是IPI的函数。（B）eCAPN1时延的组均值作为IPI的函数在10脉冲序列的最后6个脉冲中平均。（C）根据基础SGC堆积密度，对单个动物的0.6msIPI进行幅度调制。回归线和参数仅基于未经处理的动物（NH和6WD）。（D）0.6毫秒IPI和16毫秒IPI之间的N1延迟差异（（B中的虚线框）是基底螺旋神经节细胞堆积密度的函数。回归线和参数仅基于未经处理的动物（NH和6WD）。NH，n＝9（C，D中n＝6）；PBS，n=9；BDNF，n=11；THF，n=11只动物。IPI，脉冲间隔。误差棒代表SEM。
3.3.4。脉冲序列和SGC生存为了评估脉冲序列响应与SGC生存之间的关系，IPI为0.6ms时每只动物的振幅调制以及?N1潜伏期均显示为基础SGC生存的函数（图9C，D，分别）。
对于未经处理的动物（NH和6WD），振幅调制与基础SGC存活率显着负相关（图9C）。NH动物中的振幅调制明显低于未处理的6WD动物，而BDNF和THF处理的动物似乎表现得与最正常的未经处理的6WD动物一样。BDNF处理动物通常靠近回归线，表现出eCAP调节与基础SGC存活之间的关系。但是，尽管THF处理组的平均值接近回归线，但该组的个体未遵循该线，从而明确表明eCAP调节与基础SGC存活率之间没有关系。
未经处理的动物（NH和6WD）的?N1潜伏期与基础SGC存活率密切相关（图9D）。此外，在对比的是幅度调制（图9C）中，ΔN1延迟回归更清楚地表示的未处理和处理组二者的个体动物。这表明，ΔN1延迟可以被用作用于SGC生存准确指示器，不论治疗。
总而言之，根据我们对IPG效果的观察（第3.3.1节和第3.3.2节），与未处理的动物和THF处理的动物相比，BDNF处理的动物表现出更多的正常脉搏诱发反应。
4。讨论在本研究中，我们比较了当以临床可行的方式通过耳蜗向耳蜗给药时，在感觉神经性听力损失的豚鼠模型中，BDNF和7,8,3-THF对SGC存活和神经反应性的影响明胶海绵在圆窗膜上，类似于Havenith等人的方法。[34，35]和Yu等人。[46]。根据这些先前的报告，我们预计两种化合物均可在治疗后四周内显着保留SGC，并对神经功能产生积极影响。BDNF的治疗确实导致了SGC的显着存活，并改善了神经反应能力，而THF却没有。
4.1。BDNF而非THF促进SGC存活Yu等。[46]比较了THF和BDNF的神经营养潜力，报道了在体外显着的SGC存活，这在用BDNF或THF处理后相似。此外，在体内，他们发现在明胶海绵介导的THF递送后30天，在cCx26无小鼠的基底蜗中，SGC存活率显着提高，比未处理的对照组高约3.5倍。这激发了我们的兴趣，并导致我们选择研究THF作为BDNF的小分子替代品。
以下BDNF治疗当前观察的SGC存活与我们以前使用BDNF的明胶海绵中的应用[研究线34，35]，其中存活是明显的，但不限于下底转。在本研究中，观察到SGC的保存增强到中下部，这很可能是因为BDNF的使用量（20微克）是上述研究（6微克）的三倍。相同的BDNF剂量（20微克）已在我们以前的研究实验室中使用，使用小型渗透泵作为递送方法[19，28，54]，其中的防腐作用一直延伸到根尖。这种差异表明，给药方法强烈影响治疗效果，明胶海绵介导的给药效果不如直接耳蜗输注有效。本结果还表明，BDNF剂量的增加可以进一步提高本方法的有效性。
与之形成鲜明对比的是，在我们的聋哑豚鼠模型中，尚未证实已报道的THF的体内保护作用，因为THF对SGC的存活没有任何积极作用。与假手术治疗的6WD组相比（图6A），以及与未经治疗的左耳相比（图6B），我们都没有观察到在THF处理的耳蜗中SGC的存活率提高。
4.2。BDNF治疗后的功能保存我们以前曾表明，在本研究中评估了所有ECAP特性由IPG变化量的影响19，48]。继Prado-Guitierrez等人之后。[55]，我们随后证实了这种IPG效应对SGC存活的依赖性。因此，对于本研究中未治疗的正常听力和耳聋的动物，对于所有六个eCAP特征，此效果都是可见的（图7，右栏）。BDNF处理比THF处理或6WD组在Δ最大振幅，Δ阈值，Δ动态范围和Δ水平50％方面具有更高的正常反应性，如它们与NH值的相似性所说明（图7C，I，L，O）。N1-P2最大振幅随着双相电流脉冲的IPG的增加而增加，而刺激阈值降低。耳聋的这种作用比NH动物更大，可能是因为退化的SGC具有更高的激发阈值，并且需要更多的时间来引发和传播动作电位[48]，因此与健康的SGC相比，IPG的增加受益更多短IPG的电流脉冲几乎与长IPG的脉冲一样好。随着IPG的增加，失聪动物的动态范围也会增加，这可能是SGC种群的神经元间激发阈值变化增加，因为阈值高的细胞只能募集更长的IPG[48]]。这些eCAP措施在治疗后与正常听觉反应的相似性表明，经BDIP处理的SGC在短IPG的情况下仍能有效发挥作用，即优于未治疗的6WD动物。水平的50％时，刺激水平达到半最大振幅依赖于两个刺激阈值和动态范围。阈值降低和动态范围增加对50％的水平有相反的影响。这可以解释为什么用BDNF处理的动物与THF处理的动物在Δ水平50％上有显着差异，但在Δ阈值或Δ动态范围上没有显着差异。
简而言之，这表明，尽管存在的SGC数量少于健康状况，但BDNF治疗后存活的SGC表现出与健康细胞相似的功能。这是通过在文献[IPG效果和SGC填充密度之间的观察到的相关进一步证实19，48]，并且在本研究中（图8）。Ramekers等。[19]显示最大振幅，最大潜伏期和最大水平50％的IPG效应与用渗透泵进行BDNF治疗后的SGC存活率呈正相关，用BDNF处理的动物表现出正常水平的最大水平?50％SGC较少。通过我们的明胶海绵介导的递送，与单独的基础SGC生存相比，我们观察到了最大振幅和最大水平50％的相似结果。
耳蜗神经健康的第二个指标是响应脉冲序列的eCAP调幅，这已表明可指示未经治疗的动物[51]和BDNF治疗的动物[19]的SGC存活率，这一点已在当前得到证实研究。重要的是，尽管在上述两项研究中我们使用了相对较长的（ms）脉冲序列，但我们在这里表明，持续时间10ms的脉冲序列（例如10个IPI脉冲为0.6的脉冲序列）可以获得类似的有效耳蜗神经健康测量多发性硬化症）。这不仅使完成eCAP记录所需的时间减少，而且由于高频脉冲序列可能使响度感知增加到不舒服的水平，因此该措施在临床上更加适用[56]。虽然用BDNF和THF处理的动物的组平均值确实重叠以进行幅度调制（图9A），但这并未反映在SGC的数量中（图9C）。因此，THF可能确实对SGC功能（即，对高频刺激的响应性）有影响，而对细胞存活没有影响。除了这一特定观察，我们无法找到用THF处理后电生理改变的证据，无论是阳性还是阴性。
4.3。THF的难以捉摸的作用由于我们预期THF至少与BDNF的作用匹配，因此THF处理缺乏任何作用是令人惊讶的。更重要的是，自最近以来，在小鼠和大鼠的体外研究中，已发现THF可有效地促进TrkB依赖性的背根神经节外植体[57]和耳蜗SGC外植体[47]中的神经突生长。Frick等。[47]比较了BDNF和THF对神经突生长的影响。他们报告说，尽管THF促进了P7NMRI小鼠耳蜗螺旋神经节外植体中的神经突向外生长，但这种作用要比BDNF小，后者导致了P3至P7超出控制水平的向外生长。由于我们在组织学分析（即对周围过程的评估）中没有研究神经突的长大，因此我们无法证实这些结果。这些前述结果确实表明，THF对SGC具有影响，但是与BDNF相比其作用有限。
THF可能不会像BDNF一样激活TrkB。研究DHF（其是THF的衍生物）的研究报告了其与TrkB细胞外域的Ig2区[58]和CC2区[42]的结合，该区与BDNF结合位点重叠。此外，尽管依赖于神经元成熟，但DHF诱导TrkB和AKT（PI3K-AKT途径的一部分，与细胞存活和细胞生长相关的次要下游途径）的磷酸化[59]。相反，Boltaev等。[37）测量了DHF的TrkB和AKT磷酸化，发现DHF没有导致两者的磷酸化。尽管后者可以解释在本研究中观察到的THF处理后SGC缺乏存活的情况，但这些矛盾的发现表明THF对TrkB的作用尚待充分了解。
4.4。方法上的考虑小鼠的耳蜗液体积比豚鼠的耳蜗体积小10倍[60]，其中小鼠的耳蜗有4个半圈，而豚鼠的耳蜗有8个半圈（[61]，图1）。因此，两种物种之间THF分子在整个耳蜗中的扩散将明显不同，这可以解释为什么Yu在小鼠中发现了一种效果，而这种效果在豚鼠中并没有观察到，甚至可以通过扩展而在人类中发现（约60个较大的耳蜗）。体积比小鼠;[60]）。
其次，在实验之前，我们遇到了THF溶解度的问题，因为成功创建0.μg/μLTHF溶液需要至少15％的DMSO。相反，Yu等。[46]设法只用0.1％DMSO生成了类似的THF溶液（0.μg/μL）。这种强烈的差异至少是非常明显的，除了耳蜗体积的差异外，还可能影响了THF的性能。注意，用相同的DMSO浓度，BDNF有实质性的神经保护作用，这是比先前报道甚至更强[34，35]。此外，由于在6WD动物中，经治疗和对侧耳朵的SGC存活率没有差异，因此15％DMSO不太可能对SGC产生负面影响。但是，使用含15％DMSO的溶液来治疗人类是不可取的。因此，即使不考虑用BDNF获得的更好结果，用后者治疗也是优选的。
5。结论我们着手研究使用临床上可应用的方法对BDNF和THF的保护作用，而不是已经证实BDNF积极影响SGC生存和神经功能的耳蜗输注的更具侵入性的手段。当以明胶海绵介导的方式使用时，尽管先前报道有相反的证据，但BDNF确实能保留SGC及其功能，而THF却不能。因此，将BDNF作为一种保护听觉神经的手段是未来的审慎做法。此外，本研究强调了几种eCAP措施（包括IPG效应）与SGC生存之间的相关性。这是特别有用的，因为这些结果度量可以潜在地用于估计人类CI用户的神经健康。
作者贡献概念化，DR，HV和HGXMT；方法论，DR和HV；DR和HAV软件；验证，DR和WCvD；形式分析，HAV，DR和WCvD；调查，HAV，DR和WCvD；数据管理，HAV；写作-原始草稿，HAV，DR和HV；写作—审查和编辑，HAV，DR，HV，HGXMT和WCvD；可视化，HAV和DR；监督，灾难恢复和高压；所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。
资金这项研究由荷兰的Heinsius-Houbolt基金会资助。
致谢我们要感谢FerryHendriksen的组织学处理，以及MarkHuurneman和RochelleMatula的组织学分析和手术帮助。此外，我们还要感谢奥地利因斯布鲁克的MED-ELGmbH提供eCAP记录设备和技术支持。
利益冲突作者宣称没有利益冲突。资助者在研究设计中没有作用；在数据的收集，分析或解释中；在手稿的撰写中，或在决定发表结果时。
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