优化Cas9系统双重锁定显性单基因
突变成功治愈小鼠渐进性耳聋
生命科学新闻稿大赛
正文
研究单位：HarvardMedicalSchool，TheMassachusettsGeneralHospital等
疾病及相关靶点
Tmc1（transmembranechannel-like1）是维持耳蜗毛细胞正常功能必需蛋白，该基因突变可致常染色体隐性耳聋DFNB7DFNB11及常染色体显性耳聋DFNA36。人类Tmc1相关常显耳聋表现为渐进性听力损失，患者出生后进行性听力下降，在约25岁时发展为严重耳聋。携带错误表达Tmc1基因小鼠成为贝多芬小鼠，关闭/沉默突变Tmc1基因可保护小鼠听力。Highlight
筛选出对突变基因更精准识别的SaCas9-KKH。该Cas9蛋白来源于金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus而非传统酿脓链球菌Streptococcuspyogenes。
筛选出目标进行靶向性更高的gRNA4.2。SaCas9-KKHgRNA4.2RNP能够不影响野生型等位基因，高效选择性的编辑显性突变位点。
实验思路
figure1.分析不同Cas9蛋白PAM序列与靶向基因match关系
1.小鼠成纤维细胞水平RNP组合筛选
在Tmc1Bth/WTTmc1WT/WT小鼠成纤维细胞中从多种Cas9蛋白和不同全长/截短gRNA组合中筛选出SaCas9-KKHgRNA4.2RNP，且99%的剪切发生在缺陷基因上。（适当降低gRNA互补区长度可降低脱靶率，Fu,Yanfang.etal."ImprovingCRISPR-CasnucleasespecificityusingtruncatedguideRNAs."NatureBiotechnology32.3():-）2.贝多芬小鼠内耳注射验证基因编辑效率
a.将细胞实验筛选的RNP用腺相关病毒载体包装，将1ml病毒制剂注射入出生1天小鼠内耳，（如图c），在7、14、27、42、55、天检测基因编辑效率，indel（表示基因编辑率）在贝多芬小鼠呈递增趋势，且indel在野生型小鼠天与空白对照（未注射病毒制剂组）没有显著性差异。
b.ABR听性脑干反应测试auditorybrainstemresponse：检测不同声音强度刺激下脑电波反应，验证听功能。未经治疗贝多芬小鼠在24周左右完全失聪，正常小鼠保持正常听力（30dB，耳语声）。以未经治疗贝多芬小鼠为对照组，治疗组贝多芬小鼠8周后能听到约40dB声音，比未治疗组对声音敏感度提高16倍。且正常小鼠治疗后并未出现听力损失。表明该基因编辑疗法可有效安全关闭缺陷基因，成功治愈贝多芬小鼠渐进性听力损失。
c.激光共聚焦及扫描电镜观察耳蜗切片中毛细胞形态结构。未经治疗的贝多芬小鼠毛细胞结构恶化逐渐消失，接受治疗贝多芬小鼠毛细胞保持完整形态且数量正常。
3.构建Tmc1突变单倍体人细胞系，将SaCas9-KKH与3种gRNARNP转染进Tmc1DFNA36和Tmc1WT，Tmc1DFNA36被精确编辑，Tmc1WT没有编辑，验证该基因编辑策略对人的渐进性听力损失同样有效。
科学展望
ClinVar数据库分析显示，SaCas9-KKH可准确识别中缺陷基因突变。该项高度特异性和靶向性治疗策略可推广至多种由单碱基突变显性遗传病，选择性高效沉默突变基因，实现精准医疗。ASNChina
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