中华耳科学杂志,年17卷5期
例新生儿耳聋基因筛查及确诊者随访结果
分析
阮宇文铖赵雪雷王现蕾
程晓华赵丽萍张伟黄丽辉
新生儿听力损失是常见的出生缺陷之一，其发病率为1‰~3‰，位于目前筛查的几种新生儿疾病之首[1-3]。据世界卫生组织统计，全球约有4.66亿人患有残疾性听力损失，超过了世界人口的5%，其中万是儿童。除非采取行动，否则到年将有近6.3亿人罹患残疾性听力损失，到年，可能会增加到9亿人以上。听力损失病因学研究显示，大约60%的耳聋患者与遗传因素有关，遗传因素导致的听力损失在儿童听力损失患者中高达50%~60%以上[4,5]。年，北京市在全国率先开展了新生儿耳聋基因筛查工作，使新生儿遗传性聋患者及耳聋基因携带者得到早发现、早诊断、早干预，取得了良好的社会效应。耳聋基因诊断对明确耳聋病因、预防耳聋发生有着重要意义，国内学者于年验证了新生儿耳聋基因筛查能够有效提高听力损失患儿的检出效能[6,7]。本研究旨在对北京地区新生儿常见耳聋基因筛查的突变情况进行分析，了解纯合/复合杂合突变者的听力情况、干预时间及干预效果。
1对象与方法
1.1研究对象北京地区年4月~年4月期间出生、监护人签署知情同意书、并接受了耳聋基因筛查的新生儿例。
1.2新生儿耳聋基因筛查
1.2.1采血方法
由助产机构专业人员在新生儿出生后3天内采集足跟末梢血2个血斑，制成滤纸干血片，每个血斑直径不小于8mm。
1.2.2提取DNA
采用打孔器得到3mm直径的干血斑，应用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒（天根DP，北京）提取DNA，用紫外分光光度计（美国分子生物的SPECTRAmaxplus）检测DNA浓度与纯度，其最低浓度应满足工作浓度2ng/μl。
1.2.3芯片检测
本研究应用晶芯?九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（博奥生物，北京）检测GJB2(c.delC、c._delAT、c._dell6、c.35delG）、SLC26A4（c.-2AG、c.AG）、GJB3(c.CT)、线粒体12SrRNA(m.AG、m.CT)。用DNA作为模板，采用带有Tag标签序列的基因位点特异性引物对相关基因位点所在的基因片段进行扩增及荧光标记，然后与能识别相应标签序列的通用基因芯片进行杂交，最后通过对芯片进行扫描及数据分析，得到被检测的9个位点的结果。由于针对所检测的9个位点的野生型和突变型分别设计了引物和探针，因此本试剂盒可同时检测9个位点的野生型（阴性）和突变型（阳性）结果。主要设备包括：PCR仪（SPCR仪，Bio-Rad）、芯片杂交仪、芯片洗干仪及晶芯?LuxScan?10K-B微阵列芯片扫描仪。
1.3新生儿听力筛查
本研究使用的耳声发射仪为MADSEN公司的Capella，行瞬态诱发耳声发射(TEOAE)测试。筛查模式包括院内两步筛查及两步复筛，院内两步筛查即出生后48小时内在本底噪声40dB(A)的隔声室中进行初筛，对初筛未通过且住院时间超过72小时的新生儿进行第二次筛查。两步复筛即未通过院内筛查者分别于42天和／或2.5月龄时接受复筛。TEOAE测试的刺激声为短声(click)，刺激强度为70～75dBSPI，信号叠加次数为～次。TEOAE测试的通过标准为总反应强度大于或等于10dBSPL，反应波的重复率大于或等于50％，3个以上分析频率信噪比大于或等于3dB。
1.4诊断性听力学检测
未通过复筛者，于出生后3个月进行诊断性听力学检测。
1.4.1声导抗测试
应用美国的GSI–Tympstar中耳分析仪，探测音频率为Hz和1kHz，强度为85dBSPL，外耳道压力从+daPa向-daPa方向变化，压力变化速率为50daPa/s。测试时选择合适的探头，使其与耳道口密闭良好。Hz探测音鼓室图根据Liden-Jerger分型对鼓室图进行分类：A型（包括As和Ad两个亚型）、B型和C型。根据有无峰及峰的数目将鼓室图分为单峰型、双峰型及平坦型。
1.4.2ABR测试
采用美国Nicolet公司生产的Spirit诱发电位仪，于符合国家标准的电屏蔽隔声室进行。根据小儿体重服用一定量6.5%水合氯醛溶液，于睡眠状态下测试。刺激声为交替极性的短声(click)，脉宽0.1ms，刺激声起始强度80dBnHL，刺激重复率19.9次/s，分析时间12ms，带通滤波~0Hz，叠加次数次。电极：前额为记录电极，声刺激侧乳突为参考电极，眉间为接地电极。
1.4.3DPOAE测试
使用英国Otodynamics公司生产的IL型耳声发射仪，测试条件：同时使用2个刺激纯音f1、f2，强度fl=f2=70dB，f2:fl=1.22；刺激声岔的频率点为、1、、2、3、4、5和Hz。DPOAE的正常标准：每个分析频率点畸变产物(distortionproduct，DP)的值在正常范围内，同时该频率点的幅值大于该点噪声6dB。
1.4.4ASSR测试
应用丹麦EclipseASSR诱发电位仪，于符合国家标准的电屏蔽隔声室进行。采用ASSR常规参数设置，刺激声频率为：0.5kHz、1kHz、2kHz及4kHz。根据小儿公斤体重服用一定量10%水合氯醛溶液，于睡眠状态下测试。
1.4.5小儿行为测听
应用丹麦尔听美Conera纯音听力计，插入式耳机ER-3A。在符合国家标准即环境噪声20dB(A)的隔声室进行。根据婴幼儿年龄及发育状况选择行为观察测听(behavioralobservationaudiometry,BOA)、视觉强化测听(visualreinforcementaudiometry,VRA)、游戏测听(playaudiometry,PA)。测试中测试者和诱导观察者相互配合，使小儿建立良好的条件反射，获得小儿行为听阈。
1.4.6听力损失程度分级
按照WHO()制定标准[8]，以小儿行为测听气导0.5kHz,1kHz,2kHz,4kHz平均听阈评估听力损失程度分级。轻度听力损失：26~40dBHL，中度听力损失：41~60dBHL，重度听力损失：61~80dBHL，81dBHL以上为极重度听力损失。
2结果
2.1新生儿耳聋基因筛查结果2.1.1总体阳性检出情况
表1示，例新生儿中耳聋基因筛查阳性者例，总阳性检出率为4.51%（/），其中GJB2基因阳性检出率最高，为2.%（/），其次由高到低分别为SLC26A4基因1.%（/）、GJB3基因0.%（/）、线粒体12SrRNA0.%（/）及双基因杂合突变0.%（45/）。
各基因型中，GJB2基因c.delC单杂合突变的检出率最高，为1.75%（/）；其次为SLC26A4基因c.-2AG单杂合突变（1.%,/）及GJB2基因c._delAT单杂合突变（0.%,/）。
2.1.2等位基因检出率
2.1.2.1GJB2基因
表2示，本研究共检出例GJB2基因阳性者，其中纯合突变7例，杂合突变例。GJB2基因等位基因检出率为1.25%（/），其中c.delC最高，为0.91%（/），其次分别为c._delAT（0.25%，/）、c._del16（0.07%，/）及c.35delG（0.01%，10/）。
2.1.2.2SLC26A4基因
表3示，本研究共检出例SLC26A4基因阳性者，其中纯合突变1例，杂合突变例。SLC26A4基因等位基因检出率为0.78%（/），其中c.-2AG突变检出率最高，为0.67%（/），其次为c.AG（0.12%，/）。
2.1.2.3GJB3基因
本研究共检出c.CT单杂合突变例，基因型为c.delC/c.CT、c.-2AG/c.CT及c.AG/c.CT的双基因杂合突变各4例、3例及1例，GJB3基因的等位基因检出率为0.17%（/）。
2.2确诊者随访结果
2.2.1一般情况
本研究中纯合/复合杂合突变共17例，成功追访15例，失访2例。15例成功追访者平均月龄为72.93个月，均为GJB2双等位基因突变，其中c.delC纯合突变7例，c.delC/c._delAT复合杂合突变4例，c._del16/c.delC复合杂合突变4例。随访情况见表4。
2.2.2新生儿听力筛查结果
15例成功随访的纯合/复合杂合突变者中，新生儿听力筛查双耳未通过12例，占80%；双耳通过3例，占20%，其中c.delC/c.delC1例，c.delC/c._del例，各基因型的听力筛查情况见表5。
2.2.3听力损失程度
成功随访的15例纯合/复合杂合突变者均确诊为感音神经性听力损失，听力损失程度以重度及极重度为主，占66.67%（10/15），其次为中度20%（3/15），轻度13.33%（2/15），基因型及听力损失程度见表6。
2.2.4干预情况
成功随访的15例中，13例接受了听力干预，干预率为86.67%（13/15），其中双侧人工耳蜗1例，单侧人工耳蜗2例，人工耳蜗与助听器双模式6例，双侧助听器4例；2例未接受听力干预，其中1例为唐氏综合征，目前无法进行正常交流；1例双耳轻度听力损失，目前言语发育尚可，可进行一般交流。
助听器初始干预的中位月龄为6个月（3个月~3岁），人工耳蜗干预的中位月龄为18个月（8个月~4岁），初始干预月龄分布见表7。13例接受听力干预的患儿中，初始干预月龄主要集中在6月龄内，占46.15%（6/13），7~12月龄占15.39%（2/13），13~24月龄占15.39%（2/13），25~36月龄占15.39%（2/13），大于36月龄占7.68%（1/13）。
成功随访的15例患儿中，14例就读于正常小学或幼儿园，正常就读率93.33%，其中10例上正常小学，4例上正常幼儿园。
3讨论
随着新生儿听力与耳聋基因联合筛查的开展，越来越多的耳聋基因突变携带者被检出，阳性检出率及纯合/复合杂合突变者的临床听力学特点及干预情况是临床的
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